专家热评Science！杨辉组/高彩霞组“背靠背”首次发现单碱基编辑系统存在严重脱靶效应

2016年，David Liu团队在 Nature 期刊上首次报道了基于胞嘧啶脱氨酶APOBEC1（能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复）的单碱基编辑工具（BE3）首次实现可以在不引入DNA双链断裂的情况下对单碱基进行替换，2017年该团队在Nature上发表论文报道了另一种单碱基基因编辑工具——腺嘌呤碱基编辑器 (ABE)，它可以将A•T碱基对转换成G•C碱基对，加之2016报道的将G•C碱基对转换成T•A 碱基对的成果，从此研究人员首次实现了不依赖于DNA断裂而能够将DNA四种碱基A、T、G、C进行替换的单碱基基因编辑技术（目前上述两篇Nature论文总被引次数已超千次）。单碱基编辑器的开发，为定向编辑和修正基因组中的关键核苷酸变异提供了重要工具，由于该技术不引入DNA双链断裂，因此展现了其在遗传疾病治疗与动植物新品种培育等方面潜在的重大应用价值。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9从问世以来，其脱靶风险一直备受关注，如果将CRISPR/Cas9及其衍生工具贸然用于临床的话，脱靶效应可能会引起包括癌症在内的很多种副作用。尽管此前人们推出过多种检测脱靶的方案，然而由于过去的方法或者依赖于计算机软件预测，或者依赖于高通量测序检测DSB产生，还有体外检测的方法。这些方法都存在一些局限性，不能高灵敏性检测到脱靶突变，尤其是单核苷酸突变。因此关于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真实脱靶率一直存在争议。那么一种能够突破之前限制的脱靶检测技术，将会成为CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最终走上临床的关键。人们迫切希望可以找到一种既能够不依赖于脱靶位点预测，又能有足够信噪比的精密脱靶检测手段。北京时间2019年3月1日凌晨，Science杂志“背靠背”在线发表了两篇来自中国科学家完成的研究论文，分别用不同的方法在不同的物种上首次发现了单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应，这给当前如火如荼开展的相关临床试验蒙上了一层阴影。题为Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos的研究论文由中科院神经科学研究所（中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心）、上海脑科学与类脑研究中心杨辉研究组与中科院上海营养与健康研究所隶属的计算生物学研究所（中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所）李亦学研究组、斯坦福大学遗传学系Lars M. Steinmetz研究组以及中国农业科学院深圳农业基因组研究所的研究人员合作完成。该研究探索了全基因组范围内基因编辑技术可能造成的脱靶效应，建立了一种被命名为GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脱靶检测技术，并使用该技术发现: 近年来兴起的单碱基编辑技术有可能导致大量无法预测的脱靶，因而存在严重的安全风险。此研究显著提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性，并且可以在不借助于任何脱靶位点预测技术的情况下发现之前的脱靶检测手段无法发现的完全随机的脱靶位点，为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新工具，有望成为新的行业检测标准。如果要提升检测脱靶效应的精度，就必须彻底颠覆原有的脱靶检测手段。首先，为了实现不借助于脱靶位点预测，这就要求必须找到非常严格的对照组来确定基因突变的位点；同时为了检测不依赖于sgRNA的随机突变，最好使用基于单细胞全基因组测序。为了实现以上目标，杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术。研究者们在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候，编辑一个卵裂球，并使用红色荧光蛋白将其标记。小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎消化成为单细胞，利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白，分选出基因编辑细胞和没有基因编辑细胞，再进行全基因组测序比较两组差异（下图），这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。而且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，因此直接比对两组细胞的基因组，其中的差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。图片来自Science论文在杨辉实验室全体成员与合作单位的共同努力下，GOTI系统被成功建立了起来。借助于这个系统，团队成员先是检测了最经典的CRISPR/Cas9系统。结果发现，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应，这个结果结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。然而团队还检测了另一个同样被给予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术单碱基编辑系统BE3和ABE，这个系统可以精确引入点突变，在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题。在GOTI的检测下发现，ABE系统同样表现出非常高的特异性，然而BE3存在非常严重的脱靶，而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点，因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。在BE3编辑的胚胎中，平均有283个 SNVs被检测到，相比于Cre或CRISPR/Cas9处理组增加了20倍以上。而这些突变90%以上都呈现出G到A或者C到T的模式，进一步表明这些突变不是胚胎发育过程中随机产生的突变，而是由于BE3编辑所导致。这些突变随机分布于基因组中，有许多会影响蛋白的编码，甚至有一些位于原癌基因（Pin1）和抑癌基因（Rsu1, Stk4, Tsc1, Park7, Rbpj, Ing3, Hipk2, Phlpp2, Yeasts4, Ptch1, Stk3, Smchd1）上的突变，这意味着这些脱靶突变可能会进而引起癌症的发生，具有潜在风险，也就是说BE3系统不适合在临床上使用。总的来说，上述重要发现，证实了以BE3为代表的部分基因编辑技术存在无法预测的脱靶风险，让世人重新审视了这些新兴技术的风险。更重要的是，此工作建立了一种在精度、广度和准确性上远超越之前的基因编辑脱靶检测技术，有望由此开发精度更高、安全性更大的新一代基因编辑工具，建立行业的新标准。值得一提的是，上述工作曾在“基因编辑婴儿事件中”发生后的第二天就上传到生命科学预印本杂志BioRxiv上（https://www.biorxiv.org/content/early/2018/11/27/480145）。据悉，该工作从实验设计到全部完成历时一年半左右，中科院神经所博士后左二伟（现任中国农业科学院深圳农业基因组研究所研究员）、计算生物学所博士研究生孙怡迪和魏武研究员、中国农业科学院深圳农业基因组研究所助理研究员袁堂龙为本文共同第一作者，杨辉研究员、李亦学研究员以及斯坦福大学Lars M. Steinmetz教授为本文共同通讯作者。题为Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice的研究论文由中科院遗传与发育研究所高彩霞研究组完成。该研究在水稻中对BE3 (基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脱氨酶的CBE系统)、HF1- BE3（高保真版本BE3）与ABE单碱基编辑系统的特异性进行了全基因组水平评估，首次在体内利用全基因组测序技术全面分析和比较了这三种单碱基编辑系统在基因组水平上的脱靶效应。该研究对经过不同单碱基编辑系统转化的的56棵T0代水稻植株与21株对照植株进行全基因组测序。进一步序列统计分析发现，经过单碱基编辑系统处理后，基因组内的插入或删除（indels）突变的数量与对照组相比没有显著变化，但是BE3与HF1-BE3，无论是在有无sgRNA的情况下，均可在水稻基因组中造成大量的单核苷酸变异(SNVs)，且大部分为C>T类型的碱基突变。与经过农杆菌转化但不含任何碱基编辑系统的对照植株相比，BE3系统和HF1-BE3系统处理的植株在基因组范围内的C>T SNVs分别增加了94.5%和231.9%，额外产生了98个C>T SNVs和242个C>T SNVs。重要的是，与Cas-OFFinder软件预测结果比较发现，这些额外增加的C>T SNVs绝大多数发生在不是现有软件可以预测到的脱靶位点。此外，这些C>T变异在染色体间均匀分布，但呈现出在转录活跃区富集的趋势。这些区域倾向于释放单链DNA为胞嘧啶脱氨酶提供合适的底物。研究还发现，与CBE系统相反，ABE系统表现出非常高的特异性。ABE处理的植株与对照植株在全基因组范围内的SNV数量基本一致。总的来说，该研究表明现有BE3和HF1-BE3系统，而非ABE系统，可在植物体内造成难以预测的脱靶突变，因此，需要进一步优化提高特异性。该工作创新性地利用相似遗传背景的克隆植物及全基因组重测序解决了以前大量异质细胞序列分析的复杂性。据悉，高彩霞研究组博士生靳帅、宗媛以及梁承志研究组工作人员高强为本文的共同第一作者，高彩霞研究员为本文的通讯作者。原文链接：http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/27/science.aav9973http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/27/science.aaw7166 季维智（中科院院士，昆明理工大学灵长类转化医学研究院院长）CRISPR/Cas9以及Base editors等基因编辑工具在基因工程应用方面被寄予厚望，然而，脱靶效应这一争议问题一直影响着CRISPR/Cas9系统的应用。近日，杨辉等人在Science发表题为“Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos”的文章，在全基因组水平对CRISPR/Cas9和Base editors在小鼠体内（14.5天）所产生的脱靶效应进行了系统分析，首次发现cytosine base editor 3（BE3）系统会产生较为严重的单核苷酸多态（SNV，single nucleotide variants）。基于全基因组的脱靶分析，如何排除非特异背景干扰通常是影响信息学分析的一个重要因素。本项研究工作巧妙地通过对二细胞胚胎中的一个细胞进行编辑，通过荧光标记区分编辑和未编辑的细胞，从而将体内发育的个体细胞分成两个样本群，由于样本来自同一遗传背景个体，这样就在很大程度上降低了样本之间的非特异干扰。他们将这个方法命名为GOTI。运用该方法，本文对当前运用最为广泛的三种基因编辑工具CRISPR-Cas9, cytosine base editor 3 （BE3, rAPOBEC1-nCas9-UGI）和adenine base editor 7.10 （ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9）进行了深度为47X的全基因组分析。结果证明三种方法都可在小鼠胚胎中产生高效的靶向编辑。而对于脱靶效应，三种方法则大相径庭。在CRISPR/Cas9组中，除了极少数位于预测位点外的indels，并没有发现其他脱靶现象。在编辑组中检测到的SNVs数量与对照组基本保持一致，说明这些SNVs是在基因组复制的过程中自发出现的。然而，在对BE3和ABE两组的分析中发现，BE3组样本存在高达平均283的SNVs（有CRISPR/Cas9组20倍之多），ABE组则表现正常。在对BE3编辑组胚胎样本的脱靶位点进一步分析发现，这些SNVs多都富集在基因编码区，但这些脱靶效应并非来自于sgRNA的介导，很大程度上来自于过量表达的APOBEC1与DNA结合后的作用。相反，在ABE编辑组的样本中并没有观察到SNVs异常的现象，文章推测这可能是由于TadA本身缺乏与DNA结合的能力导致。base editor是目前最先进的可实现单个碱基精准替换的基因编辑工具,编辑过程中不产生双链断裂,仅需一个 DNA 单链切口就能实现单碱基精准编辑,可有效避免编辑过程中产生基因组损伤，实现高效的单个碱基的替换编辑。本文首次在全基因组水平证实BE3系统在实现高效率的碱基替换编辑时，会引起较为严重的SNVs脱靶，这对该系统的研究应用提出了挑战。然而，对于BE的后续优化版本，如BE4或BEmax，是否也存在类似现象有待深入研究。Kim Jin-Soo（韩国首尔国立大学化学系教授、基础科学研究院基因编辑中心主任）The paper is very interesting and important.We showed using Digenome-seq that cytosine base editors (CBEs) are reasonably specific in human cells, modifying fewer cites than does Cas9.Our method is limited, however, because it cannot detect sgRNA-independent mutagenic sites, if any.（这篇论文非常有意思并且其发现也有重要的意义。我们使用Digenome-seq的分析显示，胞嘧啶单碱基编辑（CBE）在人类细胞中是相对特异性的，比Cas9编辑的位点要少。然而，我们的方法是有局限性的，因为它不能检测可能存在的sgRNA非依赖性的突变位点。）The authors develop GOTI to show that CBEs can induce hundreds of unwanted, sgRNA-independent SNVs in mouse embryos.It is unclear to me whether the collateral damages are caused by the ABPOEC deaminase or the UGI moiety in CBEs.Note that CBEs are composed of ABOBEC, nCas9, and UGI (uracil glycosylase inhibitor).Adenine base editors (ABEs) lack UGI and may not cause these sgRNA-independent off-target mutations.It is now important to determine which component is responsible for the collateral mutations and how to reduce or avoid them.（文章的作者们开发了GOTI的方法，并且研究表明CBE可在小鼠胚胎中诱导数百个不需要的sgRNA非依赖型的SNV。我还不是很清楚这些附带损害是由ABPOEC脱氨酶还是CBE中的UGI引起的。值得注意的是CBE是由ABOBEC，nCas9和UGI（尿嘧啶糖基化酶抑制剂）组成。腺嘌呤单碱基编辑（ABEs）不含UGI，也可能因此不会导致这些sgRNA非依赖性脱靶突变。现在重要的是确定哪个组成部分造成了这些突变以及如何减少或避免它们。）李大力（华东师范大学生命科学学院教授）单碱基编辑工具CBE、ABE自诞生以来就备受基因编辑领域的关注。一方面因为它们不需要产生双链DNA断裂（DSB）就能够进行碱基突变，从这一点上讲它们可能比CRISPR/Cas9系统更为安全。而另一方面也是因为至今还没有一个很好的方法从全基因组的角度来研究单碱基编辑系统在体内产生的脱靶情况。由于生物体和细胞系在生长或增值过程中可能累计大量的自发突变，这些突变以单核苷酸的异质性（SNV）为主，所以很难区分哪些突变是自发产生而哪些是由于CBE、ABE进入细胞后造成的脱靶突变。近日，中科院神经所杨辉课题组与遗传发育研究所的高彩霞课题组，各自运用自己擅长的学科方法，克服了单碱基编辑工具脱靶检测的问题。杨辉课题组巧妙地运用了2细胞胚胎显微注射解决了这一问题。由于2细胞期胚胎中2个细胞的基因组背景几乎相同，所以保证了基因编辑工具刚进入其中一个分裂球时，这两个细胞的基因组几乎不会有本底水平的SNV差异。而高彩霞课题组则很好地运用了转染从同一克隆而来的水稻愈伤细胞形成植株来解决本底SNV的问题。两个团队在不同系统中的研究结果十分吻合。ABE组内的SNV与对照组的SNV相近，这些SNV很可能是细胞增殖时自发产生的突变，可见ABE工具的特异性较高。与之截然相反的是，两组人员都在BE3实验组检测到了显著高于对照组的SNV数量，在杨辉组的实验结果中两者之间的差异达到了20倍。这些SNV类型基本都是C/G>T/A的突变，更重要的是BE3的脱靶似乎与Cas9的特异性关系不大。在杨辉的实验组中，只加入Cas9/sgRNA的实验组并不会引起全基因组范围内SNV的上升，这一点也驳斥了之前关于Cas9在小鼠体内造成严重大范围基因突变的报道。而在高老师的实验组中，不加入sgRNA，或者使用高保真型Cas9（HF1-BE3）BE3都能够引发全基因组范围的C/G>T/A脱靶现象。似乎BE3的脱靶只与rAPOBEC的活性有关。由于之前检测BE3脱靶主要靠预测sgRNA脱靶位点或者体外Digenome-seq，并未发现BE3的严重脱靶现象。所以高彩霞与杨辉实验组的研究结果能够让领域内的研究人员重新评估BE3的特异性，并及时推动更为精确的CBE系统的开发（目前还不知道，YEE-BE3与eA3A-BE3在体内的脱靶情况）以及相关脱靶检测方法的改进，这对于单碱基编辑工具乃至整个基因编辑领域都具有十分重要的意义。许凯、李伟（中国科学院动物研究所）以CRISPR工具为代表的基因编辑技术以其简单、快速、高效等优点给生物学、农业和医学研究及应用带来了革命性的变化。然而基因编辑的应用仍然面临诸多挑战，其中潜在的脱靶效应是限制其应用的一个主要问题。碱基编辑技术是基因编辑技术的一个重要衍生技术。它能够不依赖DNA双链断裂（DSB），在目标基因座上直接不可逆地将一个碱基对转换为另一个碱基对，从而大幅降低双链断裂修复所导致的随机插入、缺失或易位等基因组突变。由于单碱基突变是自然界突变的主要形式之一，尤其是人类基因组致病突变的主要形式，碱基编辑技术在基因治疗等应用中具有重要前景。但是碱基编辑技术的脱靶效应仍然有待全面的检测。科学家们已经开发出多种在体外或者细胞水平进行的脱靶效应检测方法，在个体水平全基因组范围内的脱靶效应检测技术和方法近期也迅速发展。例如2018年Bradley等人报道CRISPR-Cas9会产生大片段缺失和复杂的染色体重排；Joung等人报道了利用CRISPR–Cas9在小鼠体内全基因组范围进行脱靶效应的检测和评估。但是针对单碱基突变的脱靶效应评估需要排除遗传背景、个体差异和基因复制随机突变等因素，因此常规脱靶效应评估方法往往无法有效评估。例如2017年一篇文章报道了CRISPR-Cas9基因编辑技术在小鼠体内可引发数百个位点突变，但是由于小鼠遗传背景和未设置好对照组等原因，导致结果受到大量质疑最终文章撤稿。针对碱基编辑技术的脱靶效应检测， Kim和Songyang等人曾分别进行全基因组范围内的脱靶效应的评估，发现胞嘧啶碱基编辑器（CBE）具有很高的特异性；而腺嘌呤碱基编辑器（ABE）也非常特异，只有很少的脱靶效应。然而更加可靠的的检测单碱基突变的方法仍然有待发展。在本期Science发表的来自杨辉/李亦学/ Steinmetz和高彩霞研究团队的两篇文章针对碱基编辑技术可能的脱靶效应进行了全基因组系统评估，并发现了胞嘧啶碱基编辑器（CBE）会引发大量非特异脱靶突变而腺嘌呤碱基编辑器（ABE）具有较高特异性这一重要现象。杨辉/李亦学/ Steinmetz团队开发了GOTI技术方法，通过在小鼠的2细胞胚胎的一个卵裂球中注射碱基编辑等基因编辑工具和Cre介导的谱系标记，把来自同一个个体的进行和未进行碱基编辑的细胞进行有效区分，同时通过同一受精卵来源有效避免了个体差异等因素导致的单核苷酸变异干扰。他们发现CRISPR-Cas9和ABE系统在编辑细胞中产生的插入缺失突变（Indels）和单核苷酸突变（SNV）非常少，和软件预测的脱靶位点并没有重叠，与未编辑细胞中产生的突变没有明显差异，说明这些突变可能是由自发突变产生的。然而CBE系统产生的SNV比对照组高20倍，并且这些SNV主要是C>T和G>A突变，而且CBE产生的这些SNV突变与软件预测的脱靶位点并没有重叠，是不依赖于sgRNA序列的。这些结果表明CBE系统则会产生大量的脱靶导致的单核苷酸突变。这项工作通过GOTI方法排除了由于小鼠遗传背景和个体差异而产生的单核苷酸变异，证明CRISPR-Cas9和ABE系统具有很高的保真性，而CBE则会产生脱靶突变。在高彩霞研究员团队进行的一项独立研究中，他/她们利用全基因组测序对CBE、CBE-HF1和ABE处理过的水稻植株进行了全基因组范围内的脱靶突变的检测，发现CBE系统会明显地产生脱靶单核苷酸突变，而ABE系统则具有很好的保真性。这项工作首次在植物体内（in vivo）全基因组范围内评估了CBE和ABE碱基编辑系统的脱靶效应，为提高碱基编辑工具的特异性指明了方向。这两项工作相互印证，利用不同的模式生物体系很好的证明了CBE碱基编辑工具存在较为严重的脱靶风险。同时基于这两项工作，为什么CBE碱基编辑会比ABE碱基编辑具有更高的脱靶效应、以及这些脱靶效应会在个体水平产生哪些功能改变等问题仍然有待进一步探索。这两项工作的重要发现告诉我们在利用碱基编辑工具开展相关应用尤其是临床应用之前，审慎地开展脱靶效应等安全性评估非常重要，否则CBE碱基编辑存在的严重脱靶效应可能导致重大安全性问题。同时这两项工作也充分说明继续开发安全高效的基因编辑工具仍然是该领域存在的重大需求。（来源：微信公众号“BioArt”）科研管理新闻科研管理系统